Метод получения протопластов микроорганизмов и оценки их выхода

Определение содержания микроорганизмов

Методы анализа

Количество микроорганизмов определяли методом высева на плотную питательную среду. На первом этапе определения исследуемые микроорганизмы выращивались на скошенном агаре в течение 24 часов.. Далее проводили смыв выращенных микроорганизмов физраствором. После смыва получали несколько разведений по схеме 0,5 см³ полученного раствора и 4,5 см³ физраствора. Далее отбирали по 0,1см³полученных растворов. Отобранное количество засевали в чашки Петри с приготовленной агаризованной средой. Равномерный засев проводился при помощи шпателя. Засеянные чашки помещали в термостат с температурой 37ºС и выдерживали там в течение трех дней для роста колоний микроорганизмов. После накопления биомассы микроорганизмов были проведены подсчеты выросших колоний и рассчитано общее количество клеток выросших на данных чашках. Расчеты проводились следующим образом:

1. подсчитывали количество выросших колоний на каждой чашке и рассчитывают среднее количество колоний ():

= ∑а_i/n, i = 1,…, n. (3)

2. подсчитывали общее количество микроорганизмов в анализируемой среде () по формуле:

= ∙10∙f/ υ, (4)

где f – степень разведения исходной культуры клеток; υ – объем пробы для посева, вносимый в чашку.

Для того чтобы не проводить трудоемкую и длительную процедуру определения содержания микроорганизмов в исследуемой суспензии методом высева на плотную среду, была проведена градуировка по следующей схеме:

1) чистую культуру исследуемых микроорганизмов из лабораторной коллекции высевали бактериологической петлей на скошенный агар и инкубировали при 37°С в течение 24 часов;

2) осуществляли смыв со скошенного агара физраствором и готовили три разведения по схеме 0,5 мл полученного раствора и 4,5 мл физраствора;

3) определяли концентрацию микроорганизмов (кл/см³) в растворе, полученном при первом разведении, и рассчитывали концентрацию последующих разведений, руководствуясь тем, что разбавление проводилось в 10 раз;

4) измеряли оптическую плотность полученных растворов и строили зависимость в координатах «Концентрация - Оптическая плотность». Полученные зависимости представлены на рисунках4 и 5:

Рисунок 6 – Градуировочная зависимость оптической плотности суспензии микроорганизмов Bacillus subtilis от концентрации

Рисунок 7 – Градуировочная зависимость оптической плотности суспензии микроорганизмов E. coli от концентрации

Используя линейность градуировочной зависимости в области концентраций (10⁵ – 10⁷) кл/см³, нет необходимости для каждой отдельной операции проводить высев микробиоты на твердую среду для определения количества микроорганизмов.

Культуры исследуемых микроорганизмов разводят питательным бульоном в соотношении 5 мл к 15 мл и выращивают при 30°С в течение 150 минут.

Выращенные клетки осаждают центрифугированием при частоте 5000 мин^-1 в течение 10 минут. Супернатант сливают, а в центрифужные пробирки добавляют 2 мл жидкой гипертонической среды ММ9 для получения протопластов, которая содержит лизоцим в концентрации 1000мкг/мл. Бактериальные суспензии тщательно ресуспензируют и инкубируют при 30°С в течение 20-30 минут.

Среду ММ9 готовят следующим образом: смешивают с поддержанием условий асептики 3 объема стерильной дистиллированной воды и 1 объем солевого концентрата М9 (×4). В среду добавляют стерильные растворы CaCl₂(концентрация 0,0001М), MgSO₄(концентрация 0,001 М), глюкозы (концентрация 0,2%).

Солевой концентрат М9 готовится следующим образом: растворяют в 1 л дистиллированной воды: Na₂HPO₄– 24,0 г; KH₂PO₄– 12,0 г; NaCl– 2,0 г; NH₄Cl– 4,0 г. Доводят рН до 7,2. Стерилизуют автоклавированием при 0,12 МПа в течение 40 минут.

Выход протопластов (В) ― это отношение концентрации протопластов к концентрации исходных клеток:

(1)