Роль PCNA в эксцизионной репарации оснований

Хотелось бы отдельно остановиться она роли PCNA в процессах репарации.

Как уже говорилось, у высших эукариот эксцизионная репарация оснований протекает двумя альтернативными путями – с коротким и длинным ресинтезируемыми фрагментами. Их еще иногда называют ДНК-полимераза-β-зависимый и PCNA-зависимый пути.

PCNA-зависимый путь репарации АР-сайтов был совсем недавно реконструирован in vitro с участием АР-эндонуклеазы (АРЕ1), RFC, PCNA, FEN1, ДНК-полимеразы– δ и ДНК-лигазы I. При репарационной реакции в этой реконструированной системе преимущественно замещаются два нуклеотида. PCNA является обязательным участником этой системы и подавление его активности специфическими антителами приводит к ингибированию репарации АР-сайтов в клеточных экстрактах млекопитающих.

У дрожжей показано, что некоторые мутации в гене PCNA приводят к резкому снижению репарации после действия MMS (метил-метан-сульфоната, очень сильного мутагена), не затрагивая при этом их ростовой активности. К настоящему времени сложилось представление, что у дрожжей все пути BER PCNA-завимые.

Таким образом, polβ в процессе BER принимает участие и в PCNA-зависимом и в PCNA-независимом (polβ—завимом) путях. PCNA-зависимых путей тоже 2 – в первом из них вставляется 2 нуклеотида, а в другом – около 10–12 нуклеотидов. Может быть, это связано с тем, какая из полимераз – δ или ε будут использованы при этом, но прямых данных об этом нет, так как в системе in vitro замена одной на другую на уровень репарации не влияла.

Установлено, что PCNA может напрямую взаимодействовать с большой субъединицей RFC (состоящего из 5 субъединиц), экзонуклеазой FEN1, ДНК-полимеразой-δ (третья субъединица) и ДНК-лигазой I. Это взаимодействие происходит благодаря наличию во всех этих белках консервативного мотива QXX(I/L/M)XX(F/N)(F/Y), содержащего 8 аминокислотных остатков. Наличие этого мотива в различных белках представлено на рис. 7. PCNA служит молекулярным адаптером для привлечения всех этих белков в зону репаративной реакции. Данный мотив был обнаружен и у достаточно большого числа других белков – MSH2, MLH1 (белков, участвующих в эксцизионной репарации неспаренных оснований, MMR), р21, GADD45, циклина D, ДНК-цитозин-5-метил-трансферазы (MCMT), эндонуклеазы XPG. Для р21 опубликовано очень подробное описание его взаимодействия с PCNA, включающее вовлечение в этот процесс вторичной структуры белков.

На той же модели было показано, что эффективность репарации резко падает при использования в экспериментальной системе in vitro мутантных форм FEN1 и лигазы I, у которых не нарушена ферментативная активность, а только поврежден сайт их связывания с PCNA.

Рисунок 7. Белки, имеющие сайт QXX(I/L/M)XX(F/N)(F/Y) для связывания с PCNA

Остается неясным, как все эти молекулы с PCNA-связывающим мотивом умудряются связаться с PCNA одновременно – ведь PCNA является гомотримером и может быть одновременно связан по данному мотиву не более, чем с тремя белками, а таких белков описано уже как минимум 15. Можно предположить, что в системе BER PCNA преимущественно связан с ДНК-полимеразой-δ(ε), FEN1 и лигазой I. Связывание же со всеми остальными белками, вероятнее всего, зависит от места и времени протекания реакции, в которую вовлечен PCNА и данные белки.